上期为大家详解了部分案件STR试剂盒性能评估指标:分型准确性、检测灵敏度、抗抑制能力、降解样本能力、如何区分抑制和降解、种属特异性,如果有错过的小伙伴可以翻看上篇文章哦!
· 峰高均衡性
· 体系宽容度
· 片段精确性
· 混合样本分型能力
· Stutter比例
峰高均衡性
峰高均衡性是衡量案件STR试剂盒等效扩增的重要指标。主要包括杂合均衡性,同一荧光标记物内的均衡性(色内均衡性),不同荧光标记物间的均衡性(色间均衡性)。
杂合均衡性体现了一个基因座两个不同等位基因间的扩增是否等效,一般来说模板量越高,杂合均衡性越好,一
般要求当DNA模板量大于0.5ng时,杂合均衡性大于0.7,而DNA模板量过低时,杂合失衡现象会更加严重;色内均衡性体现了同一荧光标记的不同基因座间的均衡性,一般要求DNA模板量大于0.5ng时,色内均衡性大于0.5,色内均衡性在遇到抑制物或者降解时,很容易被打破;色间均衡性体现了试剂盒整体的均衡性,涉及荧光强度与仪器兼容性等,一般要求DNA模板量大于0.5ng时,色间均衡性大于0.3。
色内均衡性
色间均衡性
体系宽容度
体系宽容度是指案件STR试剂盒在一定的范围内,可以接受的误差。包括退火温度宽容度和关键成分宽容度。
退火温度宽容度是指在试剂盒推荐最佳退火温度上下2-3℃,测试其等位基因能否完全检出,体现为对不同PCR仪和PCR仪的不同孔位的温度误差的容错能力;关键成分宽容度是指在一定的操作误差范围内,试剂盒的稳定性不受影响。按照SWGDAM的要求,需要进行Mg2+以及酶量的宽容度测试,但由于目前的商用试剂盒已经将酶、Mg2+和PCR Buffer统一配成了一个组分——PCR MasterMix,所以关键组分宽容度的考量逐渐被弱化。
除此之外,PCR的循环数,应该在试剂盒推荐的循环数基础上,增减循环数,仍能满足检测要求。这主要是考虑到实际的案件检材的样本浓度范围跨度较大,而且目前实际应用当中一般不会样本DNA定量引起。
片段精确性片段精确性是指在遗传分析仪的不同毛细管以及邻近的run之间,同一等位基因的片段大小的误差。
这是由于遗传分析仪的片段分析的相对性引起的,不同的毛细管泳道以及不同时间的电泳,得到的分子量片段存在一定的误差。片段精确性一般采用重复电泳案件STR试剂盒的等位基因ladder来评价,通过计算ladder的所有片段的标准误差,来确定片段准确性,一般情况下,连续3个run的ladder片段误差应该在0.3bp以内,否则案件STR试剂盒容易在实际使用中出现OL峰。

片段精确性
由于实际案件当中的脱落细胞面临两个样本甚至多个样本混合的情况,所以案件STR试剂盒的混合样本分型能力至关重要。
目前,评测混合样本分型能力是将两个已知分型的标准DNA按照不同比例混合,然后检查两者不同等位基因检出情况。目前大部分案件STR试剂盒对于1:7及以下的混合样本,具有一定的分型能力。混合样本分型能力主要受到两个因素的影响,一个是试剂盒的等效扩增,即经过扩增后检测到的峰高比例保持原有的样本的混合比例;二是下文要介绍的Stutter比例。
序号 | 混合 比例 | 9948 | M2 | 25A | VFP | ||
|
|
|
| 9948 | M2 | 9948 | M2 |
1 | 1:0 | 0.5ng | 0ng | 18 | 0 | 18 | 0 |
2 | 1:1 | 0.25ng | 0.25ng | 18 | 20 | 18 | 20 |
3 | 1:3 | 0.125ng | 0.375ng | 18 | 20 | 18 | 20 |
4 | 1:7 | 0.0625ng | 0.4375ng | 18 | 20 | 18 | 20 |
5 | 1:15 | 0.03125ng | 0.4675ng | 17.5 | 20 | 17.5 | 20 |
6 | 1:30 | 0.015625ng | 0.484ng | 13.5 | 20 | 15.5 | 20 |
7 | 0:1 | 0ng | 0.5ng | 0 | 20 | 0 | 20 |
8 | 3:1 | 0.375ng | 0.125ng | 18 | 20 | 18 | 20 |
9 | 7:1 | 0.4375ng | 0.0625ng | 18 | 20 | 18 | 20 |
10 | 15:1 | 0.4675ng | 0.03125ng | 18 | 16.5 | 18 | 17.5 |
11 | 30:1 | 0.484ng | 0.015625ng | 18 | 13 | 18 | 16 |
这种Stutter出现的比例随着重复单元的碱基数和重复次数的不同而变化,一般重复单元的碱基数越少,其Stutter比例越高,所以5碱基重复的Penta E和Penta D的Stutter小于几乎所有的4碱基重复的STR基因座,4碱基重复的STR基因座小于3碱基重复的STR基因座;而对于同一基因座,重复次数多的等位基因,要比重复次数少的等位基因Stutter比例更高。
Stutter形成的理论相对复杂,但在图谱中观察到的大部分Sutter,都在少一个重复单元的地方出现,称为Minus Stutter;有些以3碱基为重复单元的基因座(如D22S1045、DY392、DY481等),还会出现多一个重复单元的Stutter,称为Plus Stutter。因此为了保证STR分型的准确性,需要对群体进行分析调研,对每个基因座设置Stutter过滤值。